ТЕМА 2. Иммунологические методы исследований.

Понятие об иммунограмме

Актуальность темы. Актуальность изучения методов исследования, которые применяются в клинической иммунологии обусловлена тем, что знание этих методов, правильная интерпретация результатов исследования, позволяет выявлять дефектность того или иного звена иммунной системы (врожденные и приобретенные иммунодефициты); диагностировать аутоагрессию против собственных веществ организма (аутоиммунные заболевания) и избыточное накопление иммунных комплексов (болезни иммунных комплексов); выявлять дисфункции, при которых в том или ином звене иммунитета развиваются признаки гиперфункции в ущерб функционированию других звеньев (гипергаммаглобулинемия, болезнь тяжёлых цепей, миелома и др.); осуществлять контроль за эффективностью иммунодепрессивной или иммуностимулирующей терапии; проводить типирование и подбор доноров при пересадке органов и осуществлять контроль за проведением иммунодепрессивной терапии при трансплантациях; проводить фенотипирование гемобластозов; диагностировать генетическую предрасположенность к заболеваниям.

Общая цель: овладение принципами клинических методов обследования (сбор иммунологического анамнеза, выявление симптомов и синдромов иммунопатологии), лабораторными методами исследования компонентов иммунной системы, умение выявлять основные иммунологические нарушения на иммунограмме, знание основ проточной цитометрии.

Задания для проверки начального уровня знаний.

1. Диагноз инфекционного заболевания подтверждается:

A) Уменьшением титров специфических антител в динамике заболевания.

B) Увеличение титров специфических антител в динамике заболевания.

2. Титр антител - это:

A) Наибольшее разведение исследуемой сыворотки, которое обеспечивает специфическую иммунологическую реакцию (агглютинации, преципитации, лизиса).

B) Наименьшие разведения сыворотки, которая обеспечивает специфическую иммунологическую реакцию.

3. Для количественного определения содержания сывороточных иммуноглобулинов разных классов чаще всего используют:

A) Реакция радиальной иммунодифузии.

B) Реакция агглютинации.

C) Метод иммуноэлектрофореза.

4. Для оценки состояния нейтрофилов определяется:

A) Количество в лейкограмме.

B) Эффективность восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).

5. Оценка функционального состояния Т-лимфоцитов может базироваться на:

A) Вычислении лейко/Т-клеточного индекса.

B) Определение диференцировочных антигенов.

C) Реакции бластної трансформации с ФГА.

D) Вычислении лейко/ В-клеточного индекса.

6. Прямой тест Кумбса используется для:

A) Определение антител к эритроцитам при синдромах гемолитической болезни новорожденных.

B) Определение антител при аутоиммунних гемолитических заболеваниях.

C) Определение антител к эритроцитам при гемолитической болезни новорожденных.

D) Для определения гемолизина.

7. Непрямой тест Кумбса используется для:

A) Определение циркулирующих неаглютинирующих антител в сыворотке крови женщин, которые сенсибилизированы Rр-антигеном.

B) Определенные циркулирующего гемолизина.

8. Реакция Ваалер-Роузе - это реакция предназначена для:

A) Диагностики ревматизма.

B) Определение ревматоидного фактора в сыворотке (анти Ig G антитела).

C) Определение функции гистиоцитов.

9. Имуноферментные методы используют для количественного определения:

A) Гормонов (инсулина, гормон роста, АКТГ, тироксин, эстрогенов).

B) Онкомаркеров.

C) нейро-гуморальных факторов.

D) Креатинина и мочевины.

E) Электролитов крови

10. Иммуноферментные методы (ELISA, ИФA) - это методы основанные на:

A) Определении содержания антигенов или гаптенов в пробе, которая исследуется путем установления отношения ферментативной активности свободных и связанных антител.

B) определении содержания антител путем ферментативной реакции.

Верные ответы на вопросы: 1 B, 2 A, 3 A, 4 B, 5 C, 6 ABC, 7 A, 8 B, 9 ABCD, 10 A.

Источники учебной информации

1. Клінічна імунологія та алергологія: Підручник/ Г.М. Дранік, О.С. Прилуцький, Ю.І. Бажора та ін. ; за ред. проф. Г.М. Драніка.- К.: Здоров’я, 2006.- 888 с.

2. Казмірчук В. Є., Ковальчук Л. В. Клінічна імунологія і алергологія.- Вынниця: Нова книга, 2006, 504 с. 

3. Андрєйчин М.А., Чоп’як В.В., Господарський І.Я. Клінічна імунологія та алергологія: Підручник – Тернопіль: Укрмедкнига, 2005.- 372 с.

4. Клиническая иммунология и аллергология: Учебное пособие/ Под ред. А.В. караулова.- М.: Медицинское информационное агентство, 2002.- 651 с.

5. Никулин Б.А. Оценка и коррекция иммунного статуса.- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.- 376 с.

6. Бурместер Г.Р. Наглядная иммунология, пер с англ. – М.: БИНОМ.Лаборатория знаний, 2007.- 329 с.

7. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения.- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2003.- 468 с.

Ориентировочная основа действия

Диагностика иммунных нарушений включает: 1) иммунологический анамнез; 2) клиническое обследование; 3) тесты in vivo; 4) лабораторные методы обследования.

Иммунологический анамнез

При сборе иммунологического анамнеза должны устанавливаться следующие данные:

1)   наследственная отягощенность: наличие у одного или обоих родителей аллергических, онкологических, хронических воспалительных, эндокринных или иммунопролиферативных заболеваний, повторяемость патологии в генеалогическом дереве;

2)   патологии развития и формирования: патологии родов, врожденные аномалии, диатезы, рахит, искусственное вскармливание, инфекции и другие патологии раннего детского возраста;

3)   вредные экологические факторы: контакт с физическими, в том числе радиационными, химическими, биологическими факторами (проживание, производственные условия), лекарствами, биологическими препаратами, влияние магнитного поля, высоких или низких температур, постоянные стрессовые ситуации;

4)   перенесенные травмы, заболевания: тяжелые или осложненные травмы, ожоги и отморожения; хронические воспалительные процессы, интоксикации, септические состояния;

5)   хронизация соматического заболевания, лихорадка неясной этиологии, неясная потеря веса тела, длительна диарея;

6)   эпизоды аллергических реакций (сезонность, возраст, аллергизирущий фактор);

7)   реакции на переливание крови и ее продуктов;

8)   ятрогенные влияния: оперативные вмешательства (аппендэктомия, тонзиллэктомия, тимэктомия при вмешательствах на сердце и проч.), лучевая и химиотерапия при онкопатології, прием глюкокортикоидов и других гормональных средств, пероральных контрацептивов, цитостатиков, противовоспалительных средств (дозы, длительность приема);

9)   вредные привычки и особенности образа жизни: курение, злоупотребление наркотиками и алкогольными напитками, гиподинамия и сидячий образ жизни и работы, гиперинсоляция, нерациональное питание, стрессы.

10)Патология беременности (бесплодие, викидиши).

Данные клинического обследования

1. Физическое обследование органов и тканей иммунной системы: лимфатических узлов, селезенки, миндалин (лимфоаденопатия, спленомегалия. тимомегалия, локальная или генерализованная гипер- или аплазия лимфатических узлов, миндалин):

2. Кожные покровы (тургор, пустулярные высыпания, экзема, дерматит, новообразования, геморрагическая пурпура, петехиальная сыпь);

3. Слизистые оболочки и пазухи (кандидоз, изъязвления, сухость, воспаление, гингивит, гайморит, цианотические макулы или папулы);

4. Бронхолегочная система (воспалительные, обструктивные процессы, бронхоэктазы, фиброз);

5. Пищеварительная и выделительная системы (воспалительные процессы, дискинезия. гепатомегалия, патология желчных, мочеполовых путей);

6. Нейроэндокринная система (воспалительные процессы центральной и периферической нервной системы, эндокринопатии, пороки развития);

7.Аппарат движения и опоры (воспалительные поражения суставов и костей, деструкции, нарушение двигательной функции);

8. Сердечно-сосудистая система (кровоточивость, воспалительные процессы, атеросклероз, тромбоз);

9.Злокачественные новообразования;

10. Наличие хронических заболеваний.

11. Особенности протекания инфекционных процессов и специфики микрофлоры, которая обусловила их развитие.. Связь между дефектами иммунного ответа и склонностью к инфекционным процессам представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Связь между дефектами иммунного ответа и склонностью к инфекционным процессам (Б. Пухлик, 1992)

Таблица 2. Связь между дефектами иммунного ответа и склонностью к неинфекционным процессам (Б. Пухлик, 1992)

Примечание: МБТ — микобактерия туберкулеза, УПФ — условно-патогенная флора.

12. В результате опроса и проведения клинического обследования следует определить типичные клинические проявления иммунопатологических синдромов, таких как: инфекционный синдром; аллергический синдром; аутоиммунний синдром; первичный иммунодефицит (преимущественно у детей); вторичный иммунодефицит; иммунопролиферативный синдром (Методические материалы кафедры клинической иммунологии и аллергологии КМАПО, 2009).

Для инфекционного синдрома характерны: длительный субфебрилитет, лихорадка неясной этиологии; хронические инфекции ЛОР-органов (синуситы, отиты), повторные лимфадениты; рецидивирующий и хронический бронхит, хроническое обструктивное заболевание легких; повторная пневмония (в сочетании с инфекцией ЛОР-органов); частые ОРВИ (у взрослых более, чем 4 раза и у детей более, чем 6 раз в год); бактериальные заболевания кожи и подкожной клетчатки (пиодермии, фурункулезы, абсцессы, флегмоны, рецидивирующие парапроктиты у взрослых); паразитарные инфекции; афтозные стоматиты, заболевания парадонта; рецидивирующий гнойный конъюнктивит; рецидивирующий герпес; хронические урогенитальные инфекции (хронический гнойный вульвит, уретрит, часто рецидивирующие циститы, хронический пиелонефрит); дисбактериоз, хроническая гастроэнтеропатия с диареей неясной этиологии; генерализованные инфекции.

Для аллергического синдрома характерны: алергопатология кожи (атопический и контактный дерматит, крапивница, отек Квинке, феномен Артюса, экзема); алергопатология ЛОР-органов; бронхиальная астма, полиноз, аллергия на пищевые продукты, лекарства, химические соединения.

Для аутоиммунного синдрома характерны: воспалительные заболевания соединительной ткани, желез, суставов (ревматоидный артрит, синдром Шегрена, синдром Фелти и другие); СКВ, дерматомиозит, склеродермия; системные васкулиты (гранулематоз Вегенера, узелковый периартериит но др.); гломерулонефрит; патология щитовидной железы, инсулинзависимый сахарный диабет, болезнь Адиссона и другие гормональные нарушения; неврологические заболевания (рассеянный склероз, миастения); неспецифический язвенный колит; цитопенические заболевания крови; аутоиммунные заболевания печени; аутоиммунные формы бесплодия, патологии беременности, тяжелые формы климактерического синдрома; некоторые виды психопатологии (шизофрения).

Для синдрома первичных иммунодефицитов (преимущественно у детей) характерно: синдром Луи-Бар – атаксия в сочетании с телеангиектазиями, пятнами гипер- и депигментации; синдром Вискотта-Олдрича – геморрагический симптомокомплекс в сочетании с экземой и тромбоцитопенией у мальчиков; синдром Ди-Джирджи – судороги с гипокальциемией, пороками развития костей лица и сердечно-сосудистой системы, гипоплазией тимуса; наследственный ангионевротический отек (недостаточность С1-ингибитора комплемента).

Для синдрома вторичных иммунодефицитов характерно: наличие длительного торпидного течения инфекционного синдрома, тенденция к генерализации процесса; аллопеции, де- и гиперпигментации кожи; СПИД; другие случаи приобретенной иммунологической недостаточности.

Для лимфопролиферативного синдрома характерны: опухоли в иммунной системе (лимфокейкозы, лимфосаркомы, болезнь Ходжкина, лимфомы, саркома Капоши); Х-зависимый рецессивный лимфопролиферативный синдром у детей: а) гиперплазия всех групп лимфатических узлов с воспалительными процессами в них в сочетании с частыми бактериальными инфекциями другой локализации; б) спленомегалия; в) мононуклеоз в анамнезе.

Тесты, которые проводятся на больном (in vivo)

К этим тестам относятся элиминационные, кожные, провокационные и тесты пассивного переноса. Предназначаются для идентификации аллергена или иммунокомпрометирующего фактора.

Элиминационная проба. Больному запрещают пользоваться определенными предметами или средствами косметики, гигиены, находиться в определенных помещениях или условиях, употреблять некоторые продукты. При подозрении на профессиональных вредности — использование отпуска.

Провокационная проба. Потенциальный аллерген вводится непосредственно в шоковый орган-мишень (слизистая оболочка конъюнктивы, бронхов или носа), или обеспечивается контакт с провокационными факторами (инсоляция, горячая грелка, кусочек льда). Реакция оценивается клинически: гиперемия, отек, нарушение функции (например, носового дыхания) и с помощью лабораторных методов: лейко- и тромбоцитопения при пищевой аллергии. Тест Адо - тест торможения миграции лейкоцитов в полости рта. До и после ополаскивания слизистой оболочки рта раствором аллергена измеряют количества лейкоцитов в промывной жидкости. При увеличении количества лейкоцитов в промывной жидкости более, как на 30 %, тест считается позитивным.

Для повышения информативности проб часто пользуются инструментальным контролем (ринопневмотахометрия, спирометрия, фиб-рогастроскопия).

Кожные пробы (разновидность провокационных). Существуют тесты накожные крапельные, аппликационные, скарификационные, прик-тесты, внутрикожные и подкожные. При оценке кожных проб учитывают общую реакцию организма (лихорадка, озноб, гиперемия лица, миалгии, головная боль), местную (гиперемия, отек, зуд в месте введения аллергена) и органную (реакция органа-мишени: бронхоспазм, ринорея или слезотечение).

Противопоказаниями для проведения кожных и провокационных проб являются: обострение аллергических заболеваний; острые интеркуррентные инфекционные заболевания, туберкулез, СПИД; декомпенсированные заболевания жизненно важных органов и систем (сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной системы, печени, почек); ревматизм, коллагенозы; злокачественные опухоли; тяжелые психические и неврологические заболевания; длительное лечение цитостатиками и глюкокортикоидами; анафилактический шок или анафилактоидные реакции в анамнезе.

Накожные пробы, скарификационые и прик-тесты оцениваются через 10-20 мин после проведения. Внутрикожные тесты оцениваются через 24 ч (для пробы Манту оптимальный срок — 72 ч), подкожные — через 24-72 ч (проба Коха — через 48 ч), аппликационные (аллерген наносится на фильтровальную бумагу, прикрепленную к коже на 12 ч) — через 12-24 ч после прекращения контакта с аллергеном.

Реакция пассивного переноса (Праустница-Кюстнера) проводится в случае, когда применение кожных или провокационных тестов противопоказано. Принцип реакции заключается в проведении кожной пробы не на больном, а на здоровом добровольце (например, матери больного ребенка), которому предварительно подкожно вводят сыворотку больного (фиксируют в коже "чужой" реагин).

Лабораторные исследования

Исследование факторов естественной резистентности организма

Определение С-реактивного протеина Метод выявления С-реактивного белка в сыворотке крови основываются на его способности вступать в реакцию с С-полисахаридом к пневмококку. Нормальная концентрация в плазме крови составляет 0,8 – 8,0 мг/л (иммуноферментный метод). Повышение концентрации происходит при острых воспалительных заболеваниях, опухолях, инфаркте миокарда, внутриматочной инфекции, хронических воспалительных заболеваниях.

Определение пропердина Пропердин – белковый компонент сыворотки крови человека, имеет большое значение как один из факторов естественной резистентности. С его наличием в сыворотке крови в значительной степени связывается ее бактерицидность, антитоксинную активность, способность нейтрализовать вирусы и ряд других защитных свойств.

Определение содержания лизоцима. Лизоцим – это фермент мурамидаза, которая разрушает гликозамингликаны бактериальной стенки. Активность лизоцима определяется биологическим методом серийных растворов, турбодиметричним методом и методом диффузии в агаре.

Определение бактерицидного свойства сыворотки крови. Реакция основывается на способности сыворотки подавлять рост микроорганизмов, который зависит от уровня нормальных антител, пропердину и комплемента. Разведение сыворотки позволяет установить не только ее способность подавлять рост микробов, но и силу бактерицидного действия, которое выражается в единицах. Снижение бактерицидного свойства сыворотки крови происходит при острой лучевой болезни, СПИДе, лейкопеническом лейкозе, хронических инфекциях.

Определение уровня гетерофильных аглютининов. Гетерофильные аглютинины относятся к группе так называемых нормальных антител и являются одним из факторов защиты человека. Образуются эти антитела в результате спонтанной мутации антигенами. Количество гетерофильных аглютининов постепенно нарастает к 5 годам жизни, достигает максимума в зрелом возрасте, и снижается в пожилом. В норме у здоровых лиц они встречаются в среднем разведении сыворотки 1:16, с колебанием титра от 1:8 до 1:32. количество гетерофильных аглютининов определяется с помощью реакции Пауль – Буннеля.

Определение комплемента Общую активность комплемента определяют в гемолитической системе, которая включает эритроциты барана и специфические антиеритроцитарные антитела. Образец исследуемой сыворотки сравнивают с референтной – препаратом, который представляет собой пул сывороток крови здоровых лиц с известной комплементарной активностью. Интенсивность лизиса оценивают спектрофотометричним методом через разные промежутки времени. На основе полученной кривой определяют время 50% гемолизу (Сн50). Кроме общей гемолитической активности комплемента, с помощью радиальной иммунодиффузии по Манчини определяют концентрацию отдельных компонентов комплемента (чаще С3 и С4 ).

Увеличение общего количества комплемента происходит при: обструктивной желтухе, тиреоидите Хашимото, острой ревматической лихорадке, узелковом полиартериите, дерматомиозите, остром инфаркте миокарда, язвенном колите, тифозной лихорадке, сахарном диабете II типа, синдроме Рейтера, подагре.

Уменьшение общего количества комплемента происходит при: СКВ с поражением почек, остром гломерулонефрите, сывороточной болезни, иммунокмплексных заболеваниях, циррозе печенки, комбинированных иммунодефицитах, септическом эндокардите с гломерулонефритом, рецидивирующих ангионевротических отеках, пароксизмальной холодовій гемоглобинурии, миастении Гравис, вирусном гепатите с поражением суставов, смешанной криоглобулинемии, лимфоме.

Определение показателей фагоцитоза:

Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале развития воспалительного процесса. Ее снижение приводит к хронизации воспалительного процесса и поддержанию аутоиммунного процесса, так, как при этом нарушается функция разрушения и выведения циркулирующих иммунных комплексов из организма.

Фагоцитарное число: среднее количество микроорганизмов, поглощенных одним нейтрофилом крови. Характеризует поглощающую способность нейтрофилов. В норме составляет 5 – 10 микробных частей.

Процент фагоцитоза – процент нейтрофилов, которые принимают участие в фагоцитозе. В норме составляет 65 – 95 %.

Повышение показателей наблюдается при: антигенном раздражении в результате бактериального воспаления (продромальный период, период острого проявления инфекции) при нормальной активности фагоцитоза; лейкоцитозе; аллергических реакциях; аутоиммунных заболеваниях; усилении антителозависимой цитотоксичности и реакции на донорский трансплантат.

Снижение показателей наблюдается при: хронических воспалительных заболеваниях бактериальной и вирусной природы; врожденных дефектах фагоцитарной системы, синдроме Чедиака – Хигаси, болезнь Дауна, СКВ, коллагенозах, болезни иммунных комплексов, дефиците иммуноглобулинов, комплемента; лечении цитостатиками, иммунодепрессантами, облучением ионизирующей радиации; вторичных и первичных иммунодефицитах; новообразованиях; тяжелых ожогах, травмах, стрессах; кишечных и почечных синдромах потери белка; недостаточности питания; недостаточности фагоцитоза; хронизации воспалительного процесса.

Спонтанный тест с НСТ (нитросиний тетразолий) позволяет оценить степень антигенного раздражения не активированных in vitro гранулоцитов крови. Он характеризует степень активации внутриклеточных антибактериальных систем. Принцип метода основывается на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан под воздействием супероксиданиона, бразующегося в НАДФ – Н – оксидазной реакции, которая инициирует процесс стимуляции фагоцита. К фагоцитам добавляют желтый краситель нитросиний тетразолий, в норме при его поглощении метаболическая активность фагоцитов возрастает, нитросиний тетразолий восстанавливается, продукты этой реакции окрашены в синий цвет. О нарушении метаболизма фагоцитов судят по снижению интенсивности синего окрашивания. При выявлении нарушений определяют уровень цитохрома b558 и других белков фагоцитов. Показатели НСТ – теста повышаются в начальном периоде острых бактериальных инфекций, тогда как при хроническом течении инфекционного процесса они снижаются. Санация организма от возбудителей сопровождается нормализацией показателя. Резкое снижение свидетельствует о декомпенсации противоинфекционной защиты и является прогностически неблагоприятным признаком. Показатель спонтанного НСТ – теста в норме составляет до 10 %.

Повышение показателей наблюдается при: антигенном раздражении в результате бактериального воспаления (продромальный период, период острого проявления инфекции) при нормальной активности фагоцитоза; хроническом гранулематозе; лейкоцитозе; аллергических реакциях; аутоиммунних заболеваниях; усилении антителозависимой цитотоксичности.

Снижение показателей наблюдается при: хронических воспалительных заболеваниях бактериальной и вирусной природы; врожденных дефектах фагоцитарной системы, синдроме Чедиака – Хигаси, болезни Дауна, СКВ, коллагенозах, болезнях иммунных комплексов, дефиците иммуноглобулинов, комплемента; лечении цитостатиками, иммунодепрессантами, облучением ионизирующей радиацией; вторичных и первичных иммунодефицитах, новообразованиях, тяжелых ожогах, травмах, стрессах; недостаточности фагоцитоза; хронизации воспалительного процесса.

Индуцируемый НСТ – тест позволяет оценить функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов. Тест используют для выявления резервных возможностей внутриклеточных систем фагоцитов. При сохраненной внутриклеточной антибактериальной активности в фагоцитах резко возрастает количество формазан-позитивних нейтрофилов после их стимуляции латексом. Снижение показателей стимулируемого НСТ – теста нейтрофилов ниже, чем на 20 %, а моноцитов ниже, чем на 30 % свидетельствуют о недостаточности фагоцитоза. Величина стимулируемого НСТ – теста в норме составляет 20 -40 %.

Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов — наиболее информативный способ исследования опсонинов и функционального состояния фагоцитов.

Техника проведения:

1) Лейкоциты, выделенные из крови больного, отмывают от сыворотки, подсчитывают и помещают в среду, содержащую сыворотку здорового или больного (источник опсонинов) и живые бактерии (обычно Staphylococcus aureus или Escherichia coli).

2) Смесь инкубируют при 37°C, отбирая пробы через 0, 30, 60 и 120 мин после начала инкубации. Для определения числа жизнеспособных бактерий каждую пробу быстро охлаждают и делают посев.

3) Через 2 ч после начала инкубации смесь центрифугируют. Лейкоциты и фагоцитированные бактерии оседают на дно, а нефагоцитированные бактерии остаются в надосадочной жидкости. В осадке и надосадочной жидкости определяют число жизнеспособных бактерий.

Оценка результатов В норме в течение 2 ч фагоцитами поглощается и разрушается около 95% бактерий. При хронической гранулематозной болезни число разрушенных бактерий не превышает 10%, а внутри лейкоцитов обнаруживаются жизнеспособные бактерии. Присутствие живых бактерий в лейкоцитах при инкубации с сывороткой здорового свидетельствует о нарушении переваривания бактерий в отсутствие снижения способности к захвату бактерий. Повышенное содержание жизнеспособных бактерий в надосадочной жидкости при инкубации с сывороткой больного свидетельствует о дефиците опсонинов.

Хемотаксис лейкоцитов Нарушение хемотаксиса может быть обусловлено дефектом фагоцитов, наличием ингибиторов хемотаксиса, дефицитом сывороточных или тканевых факторов хемотаксиса.

Метод кожного окна С помощью скальпеля удаляют поверхностный слой эпидермиса площадью 4 мм² (при этом должно появиться небольшое количество крови). На поврежденный участок помещают покровное стекло. В течение суток каждые 0,5—2 ч покровное стекло меняют. Затем стекла окрашивают и исследуют под микроскопом находящиеся на них лейкоциты. В норме в течение первых 2 ч наблюдается приток нейтрофилов к месту повреждения. В течение последующих 12 ч нейтрофилы замещаются моноцитами.

Исследование хемотаксиса in vitro основано на стимуляции выделенных из крови фагоцитов факторами хемотаксиса. Способность фагоцитов к направленной миграции можно оценить, поместив их в камеру Бойдена или чашку Петри с агарозой.

Адгезия лейкоцитов Нарушение адгезии лейкоцитов обусловлено снижением экспрессии или отсутствием на их поверхности молекул адгезии, например CD11/CD18. Для определения молекул адгезии применяют проточную цитофлюориметрию. Отсутствие CD11/CD18 на нейтрофилах и моноцитах проявляется поздним отпадением пуповины, рецидивирующими бактериальными инфекциями, пародонтитом. Адгезию лейкоцитов можно также оценить по их способности прилипать к эндотелиальным клеткам.

Иммунологические тесты, которые характеризуют клеточный иммунитет (Т – звено).

Т-клеточный иммунитет оценивают по таким показателям:

- Количество T-лимфоцитов;

- Определение субпопуляций T-лимфоцитов

Проточная цитометрия проводится с использованием моноклональных антител, связанных с флюоресцентными красителями производят окраску клеточных элементов крови. Моноклональные антитела имеют идентичную специфичность к мембранным антигенам, поэтому они сгруппированы и обозначены соответствующим номером кластера дифференцирования (CD). Клетки крови поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно лазерный. Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной обработки и хранения информации.

Все T-лимфоциты имеют поверхностный рецептор (кластер дифференцировки) CD2, зрелые лимфоциты – CD3, Т- хелперы CD4, Т- супрессоры/цитотоксические Т-лимфоциты - CD-8, NK-клетки - CD-16.

Метод розеткоообразования Тест розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК, розеткообразующие клетки) применяют для выявления Т-лимфоцитов. Показано, что Е-рецепторы идентичны CD2, выявляемым моноклональными антителами и присутствуют на Т-клетках).

Е-РОК тот. – общее количество Т-лимфоцитов, образовавших розетки.

Е-РОК акт. – количество Т-лимфоцитов, образовавших активные розетки. Активные розетки образуются при четко определенном соотношении количеств эритроцитов и лимфоцитов, которое в несколько раз ниже, чем достаточно доя насыщения реакции, и без инкубации после центрифугирования.

Е – РОК+ ГТ - количество Т-лимфоцитов, образовавших гравитационные розетки. Гравитационные розетки образуются при спонтанной седиментации клеток, т.е. без центрифугирования, в течение 1 ч).

Нагрузочные тесты с лекарственными и другими веществами. В качестве такого дозированного воздействия обычно применяют инкубацию клеток в течение определенного времени с небольшими дозами, близкими к физиологическим количествам препаратов или без них. Наиболее часто подобные тесты ставят с лекарственными препаратами, в частности иммунокорригирующими (тималин, левамизол и др.) для того чтобы, определив действие препарата на клетки, прогнозировать эффективность его применения при лечении.

В розеткообразовании наиболее часто используются следующие нагрузочные тесты:

1) инкубация клеток при 37⁰С в течение 0,5-2 ч;

2) инкубация клеток в течение того же времени с растворами различных препаратов в концентрациях, близких к физиологическим, например с левомизолом, теофиллином, Т-активином, другими иммунокорригирующими препаратами;

3) инкубация клеток с различными дозами этих же препаратов.

Нагрузочный тест Е-розеткообразовання с теофиллином является способом оценки функциональных субпопуляций лимфоцитов, поскольку инкубация с этим препаратом приводит к подавлению розеткообразования преимущественно клеток, обладающих супрессорной активностью, мало влияя на клетки с хелперной активностью. Теофиллин-резистентные Т-клетки - субпопуляция Т-лимфоцитов, обладающих хелперной (CD4) активностью, теофиллин-чувствительные Т-клетки - субпопуляция Т-лимфоцитов, обладающих супрессорной (CD8) активностью.

Нулевые клетки (%) определяют по формуле 100 (%) – (Е-РОК + М-РОК).

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) Для стимуляции T-лимфоцитов in vitro используют следующие вещества.

1) Митогены — фитогемагглютинин, конканавалин A и др. — вызывают неспецифическую (не обусловленную связыванием с антигенраспознающими рецепторами) активацию T-лимфоцитов.

2) Растворимые антигены — антигены Candida albicans, столбнячный анатоксин — связываясь с антигенраспознающими рецепторами T-лимфоцитов памяти, вызывают специфическую активацию этих клеток.

3) Аллогенные клетки (в смешанной культуре лимфоцитов) активируют T-лимфоциты, поскольку несут на своей поверхности антигены HLA класса II.

4) Антитела к поверхностным антигенам T-лимфоцитов, участвующим в их активации, — CD2, CD3, CD43.

5) Химические вещества, например форболмиристатацетат (активирует протеинкиназу C) и иономицин (повышает содержание внутриклеточного кальция).

Активацию T-лимфоцитов обычно оценивают по следующим показателям.

1) Пролиферация.

2) Выработка цитокинов — интерлейкинов-2, -4, -5, интерферона гамма и фактора некроза опухолей.

3) Экспрессия маркеров активации — CD25 и антигенов HLA класса II.

4) Цитотоксичность.

Под действием митогенов, антигенов и аллогенных клеток покоящиеся T-лимфоциты активируются, превращаются в бластные клетки и начинают делиться.

Спонтанная пролиферация лимфоцитов (бласттрансформация) бывает повышена у больных, перенесших многократные переливания крови, больных аллергическими и аутоиммунными заболеваниями, при бактериальных и вирусных инфекциях, а также у новорожденных.

Оценку клеточного иммунитета проводят также с помощью кожных проб, основанных на аллергических реакциях замедленного типа. Антигены для проведения проб подбирают на основании данных анамнеза. Положительная реакция при проведении кожных проб позволяет исключить тяжелую недостаточность клеточного иммунитета, тогда как отрицательная реакция не имеет диагностического значения. Дозы антигенов для проведения кожных проб приведены в табл. 4.

При проведении этого исследования необходимо соблюдать следующие правила.

1. Следует удостовериться в активности антигена, для чего кожную пробу нужно сначала провести у здорового человека, чувствительного к нему.

2. Следует учитывать, что при проведении проб на фоне иммуносупрессивной терапии возможны ложноотрицательные результаты.

3. Следует выяснить, контактировал ли больной в прошлом с антигенами, используемыми при постановке проб, и если да, не было ли при этом местных или системных реакций. При тяжелых реакциях в анамнезе кожные пробы с данным антигеном не проводят или проводят с менее концентрированным антигеном.

4. Кожные пробы проводят следующим образом.

- Для каждой инъекции используют отдельный стерильный туберкулиновый шприц объемом 1 мл и иглу 27 G длиной 13 мм.

- В шприц набирают 0,1 мл раствора антигена, удаляют пузырьки воздуха.

- Антиген вводят внутрикожно в предплечье или спину.

- Сразу после введения антигена в месте инъекции должен появиться волдырь диаметром 5—10 мм. Если волдырь не появился, инъекция сделана не внутрикожно, а п/к. В этом случае антиген вводят повторно в другой участок кожи.

- Место инъекции обводят, например шариковой ручкой.

- Результаты оценивают через 24 и 48 ч. Если через 24 ч результат пробы отрицателен, можно вводить более концентрированный раствор антигена.

- Для проведения кожных проб обычно используется коммерческий набор Мультитест CMI, состоящий из 7 антигенов: Candida albicans, Trichophyton spp., Proteus spp., столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, стрептокиназы и очищенного туберкулина. Следует отметить, что оценка результатов исследования с применением этого набора часто бывает затруднена, поскольку при положительной реакции волдырь может быть небольшим (чуть более 2 мм).

Иммунологические тесты, которые характеризуют гуморальный иммунитет (В – звено).

Гуморальное звено иммунной системы оценивают по таким показателям:

• Количество В-лимфоцитов;
• Количество сывороточных иммуноглобулинов (классов A, M,G, E).

В настоящее время с целью идентификации лимфоцитов используют 3 группы методов: иммунофлюоресценция – проточная цитометрия, розеткообразование, иммуноферментный анализ.

Метод проточной цитометрии На клеточной мембране лимфоцитов находится множество гликопротеидов, которые можно обнаружить при проточной цитофлюориметрии с помощью моноклональных антител. Некоторые из этих гликопротеидов специфичны для определенного типа клеток, например T-, B- и NK-лимфоцитов, разных субпопуляций T-лимфоцитов, моноцитов, и даже для определенных стадий их созревания и дифференцировки. Эти молекулы принято обозначать CD. Определение B-лимфоцитов с помощью проточной цитофлюориметрии основано на выявлении иммуноглобулинов, фиксированных на поверхности клеток, CD19 и CD20. При оценке результатов исследования необходимо учитывать возраст больного. У детей старшего возраста и взрослых B-лимфоциты составляют 10—20% всех лимфоцитов крови, у детей младшего возраста их больше.

Метод розеткообразования основывается на наличии на мембране В – лимфоцита рецептора для Fc – фрагмента иммуноглобулинов и третьего компонента системы комплимента (С3). Они способны образовывать розетки лишь с эритроцитами миши, которые обработаны антителами и в присутствии комплемента (ЕМ–РУК). Показано, что Ем-рецепторы идентичны выявляемым моноклональными антителами CD22 и присутствуют на зрелых B-лимфоцитах. Таким образом, тест розеткообразования с эритроцитами мыши (ЕМ-РУК) используют для обнаружения В-лимфоцитов, имеющих рецепторы CD22.

Определение абсолютного количества В-лимфоцитов Абсолютное количество В-лимфоцитов в норме составляет 0,28 – 0,31 *10⁶ /л).

Повышение абсолютного количества В-лимфоцитов наблюдается при: острых бактериальных, грибковые, паразитарные заболеваниях, СПИД (начальный период), хронических заболевание печенки (цирроз, вирусный гепатит), аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, СКВ, ревматизм, коллагенозы), саркоидозе, муковисцидозе, болезни Крона, болезни Вальденстрема, моноклональной гаммапатииії, инфекционном мононуклеозе, хроническому лімфолейкозі, в остром периоде повторной инфекции.

Снижение абсолютного количества В-лимфоцитов наблюдается при: физиологичной гіпогамаглобулінемії у детей (в возрасте 3 – 5 мисс), врожденной гіпогамаглобулінемії или агаммаглобулинемии, новообразованиях иммунной системы, лечении цитостатиками и иммунодепрессантами, состояниях после удаления селезенки, недостаточности гуморального звена иммунитета.

Определение IGG, IGA, IGM методом радиальной імунодифузії по Mancini et al основан на том, что образцы исследуемых сывороток поміщують в лунки агара, который содержит антитела к Ig одного из классов IGG, IgА, IgМ в известной концентрации. Иммуноглобулины, дифундуючи из лунок в агар, при взаимодействии с соответствующими антителами будут образовывать кольца преципитации, размер которых находится в тесной зависимости от содержания в сыворотке обследуемого Ig того или другого класса. Уровень сывороточных Ig отображает функциональное состояние В-клитинной звена иммунной системы в ответ на стимуляцию организма антигенными раздражителями.

Повышение концентрации IgА наблюдается при: острой и хронической бактериальной, грибковой, паразитарной инфекции, хронических заболеваниях печенки, циррозе, ревматоидном артрите, СКВ, хроническом лимфолейкозе, миеломной болезни, моноклональной гаммапатии, болезни Вальденстрема, эндотелиоме, остеосаркоме, кандидозе, муковисцидозе, заболеваниях дыхательных путей.

Уменьшение концентрации IgА наблюдается при: физиологичной гипогаммаглобулинемии у детей (в возрасте 3 – 5 мисс), врожденной гипогаммаглобулинемии или агаммаглобулинемии, новообразованиях иммунной системы, лечении цитостатиками и иммунодепрессантами, состояниях после удаления селезенки, кишечных и почечных синдромах потери белка, острых вирусных, хронических бактериальных инфекциях.

Повышение концентрации IgM наблюдается при: острых и хронических бактериальных, грибковых, паразитарных инфекциях, острых вирусных гепатитах, циррозе, ревматоидном артрите, СКВ, остром и хроническом лимфолейкозе, миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема, эндотелиоме, остеосаркоме, кандидозе, муковисцидозе, заболеваниях дыхательных путей.

Уменьшение концентрации IgM наблюдается при: физиологичной гипогаммаглобулинемии у детей (в возрасте 3 – 5 мисс), врожденной гипогаммаглобулинемии или агаммаглобулинемии, новообразованиях иммунной системы, лечении цитостатиками и иммунодепрессантами, облучение ионизирующей радиацией, состояниях после удаления селезенки, кишечных и почечных синдромах потери белка, хронической вирусной инфекции, недостаточности гуморального звена иммунитета.

Повышение концентрации IgG наблюдается при: острых и хронических бактериальных, грибковых, паразитарных инфекциях, острых и хронических заболевание печенки, циррозе, вирусном гепатите, аутоиммунних заболеваниях, ревматоидном артрите, СКВ, саркоидозе, муковисцидозе, хроническом лимфолейкозе, миеломной болезни, инфекционном мононуклеозе, моноклональной гаммапатии, болезни Вальденстрема, реконвалесценции первичной бактериальной инфекции, при остром периоде повторной инфекции, СПИДе.

Уменьшение концентрации IgG наблюдается при: физиологичной гипогаммаглобулинемии у детей (в возрасте 3 – 5 мес), врожденной гипогаммаглобулинемии или агаммаглобулинемии, новообразовании иммунной системы, лечении цитостатиками и иммунодепрессантами, состояниях после удаления селезенки, кишечных и почечных синдромах потери белку, при хронической вирусной инфекции, гемоглобинопатии.

Иммуноглобулин Е (IgE) – класс иммуноглобулинов, обнаруженный в норме в незначительном количестве в сыворотке крови и секретах слизистых оболочек и эндокринных желез. Основная биологическая роль IgE связана с его способностью связываться с поверхностью тучных клеток и базофилов человека. Только эти клетки несут высокоафинный гликопротеиновый рецептор к IgE.

IgE принимает участие в аллергический реакциях I (немедленного) типа, а также принимает участие в защитном противогельминтном иммунитете, что обусловленно наличием перекрестного связывания между IgE и антигеном гельминтов.

Определение IgE имуноферментним методом (ELISA-тест). Аллерген, например экстракт пыльцы, иммобилизируют на сорбенте, который потом инкубируют с сывороткой больного. Количество связанного с сорбентом специфического IgE определяют с помощью антител к IgE, которые иммобилизированы в лунках на специальных планшетах.

В норме IgE составляет менее 0,001% от всего иммуноглобулина сыворотки крови. Его концентрация в сыворотке крови взрослого человека составляет не менее 0,05% г/л (приблизительно 100 кЕ/л), что в 1000 раз выше концентрации IgE специфического в сыворотке (приблизительно 10 граммов/л). Диапазон содержания IgE в сыворотке крови здоровых людей в зависимости от возраста представлен в таблице 5.

Таблица 5. Значения нормальных уровней концентрации иммуноглобулина E в сыворотке крови в зависимости от возраста.

IgE можно обнаружить в организме человека уже на II-й неделе внутриутробного развития. Содержание IgE в сыворотке крови растет постепенно с момента рождения человека к подростковому возрасту. В пожилом возрасте уровень IgE может снижаться.

Методы для выявления антител и антигенов

1. Методы, основанные на реакции преципитации - образования осадка из нерастворимых комплексов антиген-антитело в растворе, агаре, геле (нефелометрия; простая, двойная и радиальная иммунодиффузия; иммуноелектрофорез; непрямая преципитация). Таким образом в клинической иммунологии определяются уровни иммуноглобулинов по методу Манчини, происхождение крови или спермы в судебной медицине, количественные и качественные свойства белков в биохимических препаратах. В организме с помощью преципитации нейтрализуются вирусы и бактериальные (например, дифтерийный) токсины. В иммунопатологии за счет преципитации реализуется феномен Артюса (одно из проявлений гиперчувствительности), когда преципитат блокирует микроциркуляцию и тем самым приводит к локальному некрозу.

2. Методы, основанные на реакции агглютинации (прямая и непряма агглютинация) - осаждение клеток, нагруженных антигенами (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, сперматозоидов при диагностике бесплодия), иммуноглобулинами-аглютининами. Применяется в диагностике тифа и туберкулеза, иммунологического бесплодия, определении групп крови (ABO);

3. Методы, основанные на реакции лизиса бывают двух видов: а) реакция связывания комплемента (основывается на потреблении комплемента в двух конкурирующих парных системах антиген-антитело); бы) реакция комплементарной фиксации (основывается на потреблении комплемента в двух последовательно реагирующих парных системах антиген-антитело). Таким образом устанавливают уровень антител к вирусам полиомиелита, оспы, эпидемического паротита, герпеса, гриппа или бактерий гонореи, туберкулеза, сифилиса (реакция Васермана)

4. Методы, основанные на использовании меченых антител и антигенов подразделяются на:

а) иммунофлюоресцентный метод (иммунное окрашивание) - определение антигенов (прямая реакция) или антител (непряма) путем детекции флюоресцирующих (меченых) комплексов. Таким образом определяются популяции и субпопуляции иммуноцитов (метод моноклональных антител), антигены, антитела и потенциальные аллергены в сыворотке и тканях (иммуногистохимическое исследование);

б) иммуноферментный метод - определение антигенов (прямая реакция) или антител (непряма) путем их взаимодействия, соответственно, с антителом или антигеном, мечеными ферментами. С помощью этого метода можно качественно и количественно определять антигены и антитела, интерлейкины, интерфероны, иммуноглобулины, потенциальные аллергены. Модификациями этого метода является:

- ELISA-тест на ВИЧ - образование послойного "сендвича" антитело-антиген-антитело;

- вестерн-блот - проведение иммуноферментного анализа после предыдущего разделения антигенов в геле електроферезом и перенесение (блотинг) их на неподвижную бумагу.

Лабораторная диагностика аллергических заболеваний in vitro

Специфические методы аллергодиагностики направлены на:

— выявление свободных антител в сыворотке крови и секретах;

— обнаружение антител, связанных с лейкоцитами (базофилами, нейтрофилами, тромбоцитами и др.);

— определение Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к аллергену.

Определение уровня аллерген-специфичних IgE

Иммуноферментный анализ включает использование антител, меченных ферментом. Сущность ИФА состоит в том, что при добавлении исследуемой сыворотки, содержащей IgE-антитела к аллергену, связанному с полистироловой поверхностью микропланшет, образуется комплекс аллерген-антитело IgE. Количество связавшегося IgE, т. е. антител, определяют с помощью меченных ферментом антител против IgE. Для этого в лунки планшет для анализа вносят анти-IgE-антитела, меченные пероксидазой хрена (или другим ферментом) и сіворотку больного. В результате этого антитела против IgE специфически связываются с IgE, находящимся в комплексе аллерген-антитело IgE или свободніми от антигена (аллергена). В дальнейшем добавляют реагенты (орто-фенилендиамин и перекись водорода) и выявляют активность пероксидазы по цветной реакции, интенсивность которой оценивают на спектрофотометре.

Метод ИФА выявляет только «избыток» IgE, свободных антител в сыворотке крови, но не определяет антитела, связавшиеся с мембранами клеток - базофилами и другими лейкоцитами. Поэтому отрицательный тест не гарантирует отсутствие у больного «вооруженных» IgE базофилов и развитие аллергической реакции. Положительный тест на специфические IgE указывает на аллергию.

Нефелометрический метод микропреципитации по Уанье применяют для обнаружения IgG-, IgM-антител к гаптенам (лекарствам) в сыворотке крови. Готовят двухкратные разведения аллергена и сыворотки крови больного. В одну кювету фотоэлектроколориметра (ФЭК) вносят 1,5—1,8 мл исследуемой сыворотки крови (исходное разведение 1:2), в другую — контрольный раствор или сыворотку крови здорового человека. Измеряют исходную оптическую плотность на спектрофотометре (светофильтр №4, при длине волны.= 500 нм). Затем в каждую кювету добавляют по 0,1 мл разведенного аллергена, начиная с минимальной концентрации, и перемешивают. Через 2 мин снова определяют оптическую плотность смеси в кюветах. Реакцию проводят сначала с разными разведениями аллергена, затем, когда определена его минимальная концентрация - с сывороткой (для определения ее титра). Оптимальная концентрация гаптена - это та, которая вызывает задержку снижения или даже увеличение